一五六七年二月十日凌晨兩點，愛丁堡市區傳出了猛烈的爆炸聲響，許多人倉皇來到柯克歐菲爾德宮，卻只看到無情的火焰將柯克歐菲爾德宮燒成灰燼，而在果園中則找到身上僅著睡袍的達恩裡勳爵與他的隨從泰勒的屍體。兩人頸上的痕跡顯示皆系被勒死：兩人顯然並非因爆炸而死，爆炸可能只是為了摧毀謀殺的相關證據。許多人認為，達恩裡勳爵可能感到不對勁，與僕人一同離家察看，結果在外頭遭到攻擊。一名年老的鄰人曾聽到他呼喊：「兄弟，可憐我吧！以憐憫所有人的神之名！」在爆炸聲響過後，第一個跑到街上的人是威廉·佈雷艾德隊長，他是玻斯威爾侯爵的人，隨後他遭到逮捕，但他發誓自己只是在附近與朋友把酒言歡。
蘇格蘭女王當晚也被爆炸聲驚醒，當她聽聞達恩裡勳爵死亡的消息，表示感到震驚與恐懼，並矢言以最快的速度揪出殺夫兇手加以嚴懲。她同時也認定這個兇手的目的，也是殺害她：若她未前往荷裡路德宮參加婚禮，便可能慘遭不測，於是她一點時間也不浪費，隨即著手撰寫信件給各國皇室，宣佈自己「奇跡般」死裡逃生。
達恩裡勳爵毫無疑問是遭到謀殺：許多人都有陷害他的動機，他的死也讓許多人有機可乘。其中最主要的就是女王，她早已不愛達恩裡勳爵，而且想方設法要親自除掉他。她也認為達恩裡勳爵有不良企圖，最近她甚至向詹姆斯·畢騰大主教（Archbishop James Beaton）抱怨，丈夫企圖綁架兒子統治國家。
玻斯威爾侯爵也想害死達恩裡勳爵，這樣他才有機會迎娶女王，統治蘇格蘭。他是一個「誇大自負的人，有著難以想像的驕傲、兇惡與虛榮，為了自己的野心，什麼事都做得出來」。這是當時的一位人士對他的形容。
還有其他蘇格蘭貴族，也都十分厭惡達恩裡勳爵，在裡奇歐死後，這些貴族人士總認定達恩裡勳爵背叛了他們。對疑犯的推論，甚至衍生到對蘇格蘭有非分之想的外國貴族：包括天主教領導者菲利普二世、查理九世與羅馬教皇，他們都不希望看到達恩裡勳爵的醜聞糟蹋了天主教的風氣。相反，伊麗莎白女王則急切地想要在蘇格蘭擴展新教優勢，儘管有莫雷伯爵主導，但達恩裡勳爵依然是個障礙。
但對蘇格蘭與歐洲各地的貴族來說，多數人都認為證據指向玻斯威爾侯爵，而且很快就牽連到瑪麗·斯圖亞特。
二月二十四日，伊麗莎白女王即將收到來自蘇格蘭臥底的回報，指出達恩裡勳爵之死的背後，比起官方公佈的說法有更邪惡的動機，於是伊麗莎白女王從懷特霍爾宮非常緊急地寫信給瑪麗·斯圖亞特。取代以往信件「親愛的姐妹」的開頭，她寫道：
女士：
聽聞你的前夫遭到令人毛骨悚然又惡劣的手段殘殺，讓我連耳朵都豎直了，我的心也在顫抖，他是我們共同的表親，讓我難過得幾乎無法提筆寫下此信；但我仍無法隱藏，自己對你的憐憫多於他的事實。我希望能協助我那信仰虔誠的表侄女與摯友，因此我得叮嚀你保持你的傲氣，千萬不要如多數人說的一樣，動手報復那些對你壞的人。我必須規勸你，給你忠告，我請求你將我的話放在心上，未來碰上了任何困境，你便將不致恐懼。我熱切地寫下此信，並非質疑你，而是出於情感所趨。
法國王太后凱瑟琳·梅迪奇則向她週遭的人表示，瑪麗·斯圖亞特能擺脫那傻子，簡直就是天降的福氣，但同時提醒她的前兒媳，若她不盡快找出兇手並加以嚴懲，法方將視它為污點，並成為她的敵人。
瑪麗·斯圖亞特積極想要擺脫與此案的關聯，下令展開調查，但目擊證人具結書都在可疑的情形下節錄，甚至有人受到刑求。若同父異母的妹妹遭到推翻，莫雷伯爵便有可能坐上蘇格蘭王位，他負責統籌這些文件，因此這些證據全都不足採信。瑪麗·斯圖亞特可能是因為當時健康情形不佳因而變得優柔寡斷，在達恩裡勳爵死後幾周內，也不願主動對抗那個出現在愛丁堡的匿名公告中被指控為殺人凶主嫌的玻斯威爾侯爵。
達恩裡勳爵的父母則陷入極度的痛苦中，不只因為兒子之死，還因為女王對於將罪犯繩之以法，似乎興致缺缺。伊麗莎白女王將憂鬱的萊諾克斯伯爵夫人從倫敦塔中釋放出來，並將她交由理查德·薩克維爾爵士（Sir Richard Sackville）照料。唐迪亞哥大使則透露，萊諾克斯伯爵夫人一口咬定，瑪麗·斯圖亞特「某種程度上一定插手此事」，這都是為了「替她那個意大利秘書報仇」。萊諾克斯伯爵則成功地對瑪麗·斯圖亞特施壓，私下起訴玻斯威爾侯爵謀殺達恩裡勳爵，但在一次開庭中證人們因受到恐懼都不願出席，最後玻斯威爾侯爵在四月十二日遭到無罪釋放。
四月二十四日，再度從病中康復的瑪麗·斯圖亞特，前往史特林探望兒子後返回愛丁堡。玻斯威爾侯爵莽撞又不顧兩人的聲譽地——但也有可能是在瑪麗·斯圖亞特同意與事前知情的狀態下，因為她拒絕其他人的援救——綁架了她，並將她帶往敦巴，並「蹂躪」了她，以此確保瑪麗·斯圖亞特無法拒絕與他結婚的請求。
在綁架案過後不久，英國的格雷男爵（Lord Grey）帶著口訊來訪，要告訴蘇格蘭女王，對於她無法將殺夫兇手正法，反而展現出支持的意味，伊麗莎白女王感到「十分困惑」，「彷彿就如坊間傳言般涉入此般罪行」。瑪麗·斯圖亞特當時被軟禁，自然沒有接到這個口信。當伊麗莎白女王聽聞瑪麗·斯圖亞特委身於玻斯威爾侯爵時，感到驚愕萬分。
六月三日，蘇格蘭教會因玻斯威爾侯爵與妻子的一名侍女通姦，因而將他逐出教會，同時也宣佈他的妻子可合理離婚。此舉也讓玻斯威爾侯爵得以迎娶瑪麗·斯圖亞特。五月十五日，兩人在荷裡路德宮以新教儀式成婚。在那之後，瑪麗·斯圖亞特曾聲稱自己別無選擇，但許多人認為她行為墮落，因而斷定她與玻斯威爾侯爵聯手謀害了達恩裡勳爵。
伊麗莎白女王對瑪麗·斯圖亞特的舉止深感遺憾，這次與她在艾咪·達德利疑遭謀害時的處理態度大相逕庭，在一封寫給瑪麗·斯圖亞特的信件中，她勸道：「女士，我們的友情以成功來維繫，但逆境乃真正友誼之試金石，因此我必須說這些話。」她知道瑪麗斯圖亞特再婚的消息，於是說：
坦白告訴你，我們感到非常遺憾：你怎麼會做出如此錯誤的選擇，在如此倉促之下嫁給一個臣子，他除了各種惡名昭彰的缺點外，公眾也將你前夫之死怪罪於他，儘管我們知道他侵犯了你，但我們都知道這是他的錯。而且你嫁給他是件危險的事，畢竟他還有個合法的妻子，但你們兩人卻沒有合法的子嗣！
你可以無視我們的看法，但我們深感抱歉，無法抱著更好的想法。我們將誠摯地致力於運用各種力量，將任何與貴國臣子為敵的兇手繩之以法，無論你與他之間有多親密，接下來你都應該小心你的兒子詹姆士王子，保護他就是保護你自己與你的王國。
伊麗莎白女王向倫道夫表示，她「非常不欣賞蘇格蘭女王的作為，因為實在是太厭惡，因而為她感到羞恥」。而且伊麗莎白女王不支持這段婚姻，還有其他的原因。倫道夫一直以來總不斷提醒伊麗莎白女王，「相較起任何人，玻斯威爾侯爵絕對是英國永恆的敵人」。伊麗莎白女王憂心，若滿足了他的野心，他可能會煽動瑪麗·斯圖亞特與英國作對。貝福德伯爵也因此下達指示，「安撫」所有「痛恨玻斯威爾侯爵坐大」的蘇格蘭貴族。
婚禮兩天後，瑪麗·斯圖亞特已經開始後悔自己的愚蠢，而事實也證明，玻斯威爾侯爵是個不良丈夫，對一些無聊的瑣事常感不滿，並對其他貴族的勢力表現出嫉妒之意。法國大使看出她的憂傷，也聽到她尋死的念頭；她甚至有一度還想拿刀自殘。但是他發現除了心理上的憂傷之外，瑪麗·斯圖亞特其實抵擋不了玻斯威爾侯爵身體上的誘惑。
蘇格蘭貴族們無法容忍這段婚姻。好不容易才擺脫了裡奇歐秘書與達恩裡勳爵，他們根本無法忍受野心勃勃又莽撞無禮的玻斯威爾侯爵來做蘇格蘭王，於是他們很快便準備要以武力對抗他。衝突於六月十五日發生在卡伯裡山。這次起義鮮有濺血，那一天的衝突過後，瑪麗·斯圖亞特遭到貴族軟禁，而玻斯威爾侯爵則逃回敦巴，隨後再由奧克尼島出境逃往丹麥。貴族們向女王保證，他們並不想傷害她，但她隨即便發現，自己如同被囚困的重刑犯。
因此她在受到輕視的狀況下，哭著回到愛丁堡，而她的臣子們對她的看法則是毫無保留。當她進入擁擠的街道時，人們辱罵她為淫婦、殺夫兇手，甚至有人大喊：「燒了這個賤貨！殺了她！淹死她！」
「我要吊死這些人！折磨這些人！」她哭著說，但她的羞辱如此直接。街頭更張貼了公告，將人魚的形象——象徵著妓女——加諸她身上，只要有機會便挑釁她。而她的王朝顯然已經告終。
在遭到革除王權的兩天後，瑪麗·斯圖亞特被關入位於金羅斯利文湖中島上的一個城堡中。除了身上的衣服，她一無所有，在她被囚禁後幾周內，她便流產失去了一對雙胞胎，而且大失血，使得她不得不臥床休息很長一段時間。同時，瑪麗·斯圖亞特底下的貴族們，正用盡心機激起民眾對她的反對聲浪，並想方設法要處置她。
伊麗莎白女王聽聞此事，對於臣子囚禁女王背後象徵的意義感到憂心不已。無論瑪麗·斯圖亞特做了些什麼——伊麗莎白女王對她的行為也深感遺憾，但她個人一點也不憐憫瑪麗·斯圖亞特——但瑪麗·斯圖亞特依然是神聖的君主，無論是「本質上或法律上」，人們都必須對她忠誠、服從，而蘇格蘭貴族們對她的態度，已經開了一個危險的先例。一個女王遭到迫害而放棄王權，這是完全無法想像的事情。更令人警醒的是，在英國也出現了許多為推翻瑪麗·斯圖亞特喝彩的歌謠。因此讓伊麗莎白女王下定決心，要盡可能地努力救援瑪麗·斯圖亞特。
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六月二十日，玻斯威爾侯爵的一位隨從遭到逮捕，並被迫將後來被稱為「首飾盒密函」的信件交給了摩頓伯爵。「首飾盒密函」是瑪麗·斯圖亞特與玻斯威爾侯爵兩人魚雁往返的數封密函，若能鑒定真偽，便能指控女王為殺人幫兇。貴族們則向瑪麗·斯圖亞特表示，她只能選擇接受審判，且「首飾盒密函」定會成為重點證物，或是選擇退位，要不然就是與玻斯威爾侯爵離婚。她拒絕接受這些選擇，根據她的政敵們轉述，她只希望能夠搭上小船，與玻斯威爾侯爵一起出行，看看命運將他們帶往何處。此時羅馬教皇聽聞她近來的行為，也在七月二日拒絕未來與她的任何關聯。
七月初，伊麗莎白女王再度派遣瑟洛摩頓爵士前往蘇格蘭，希望能協助瑪麗·斯圖亞特與貴族達成協定，英方堅持由瑪麗·斯圖亞特復位。在完成任務後，他同時要求蘇格蘭方面找出謀殺達恩裡勳爵的真兇，並將其繩之以法。最重要的是，他也確定了詹姆士王子的安危，畢竟他對伊麗莎白女王來說，也有王權上的重要性；若有必要，瑟洛摩頓爵士可以將詹姆士王子帶回英國，由伊麗莎白女王保護他。瑟洛摩頓爵士曾告訴萊斯特伯爵「這是我政治生涯中最危險的一次出使任務」，他慢慢地朝北走，但隨後卻被皇室貴族趕上，以女王之名下令要他盡快趕路。
蘇格蘭的民眾受到約翰·諾克斯的煽動，出現反瑪麗·斯圖亞特情結，同時蘇格蘭國內對於瑟洛摩頓爵士的干預也十分反感。他們禁止瑟洛摩頓爵士接近瑪麗·斯圖亞特，蘇格蘭貴族們甚至表示，若伊麗莎白女王不願相助，便要處決瑪麗·斯圖亞特，並與英國斷交向法國示好。瑟洛摩頓爵士唯一能做的，就是寫一封信給瑪麗·斯圖亞特，建議她與玻斯威爾侯爵離婚。事情已經到了如此絕境，瑪麗·斯圖亞特依然拒絕。
蘇格蘭貴族不同意讓詹姆士王子前往英國，現在他們決定要讓瑪麗·斯圖亞特退位，由她的兒子繼位。因為小產而使身體羸弱，她根本無力抵抗；然而在七月二十四日，當她被要求簽署放棄王位的同意書時，她拒絕了，並要求召開蘇格蘭國會。林賽男爵（Lord Lindsay）威脅她若不從將割開她的頸項，她才屈從。五天後，她那還在襁褓中的兒子，便在新教儀式中，於史特林加冕成為詹姆士六世。加冕日那一天，利文湖也有瘋狂慶祝的活動，而負責看守瑪麗·斯圖亞特的守衛們，則極盡所能地侮辱她。
七月二十七日，怒不可遏的伊麗莎白女王對瑟洛摩頓爵士下達指令，要他向蘇格蘭方面表達：「他們在《聖經》中找到什麼樣的正當理由，可以推翻自己的君主？在基督教王權中，他們又找到什麼樣的法律，記載臣子可以逮捕自己的君主，軟禁君主，甚至還想審判君主？在任何法規中都找不到這樣的規定。」若瑪麗·斯圖亞特是遭到脅迫下位，伊麗莎白女王威脅道：「我們一定會直接採取行動，對付他們，向他們的王權展開報復，為後世子孫立下典範。」
瑟洛摩頓爵士認為（他也曾向萊斯特伯爵表示），若有人試圖營救瑪麗·斯圖亞特，都只會造成她慘遭殺害的命運，但同時也不會有人懷疑，若伊麗莎白女王並未以如此激烈的話語響應蘇格蘭貴族們對待瑪麗·斯圖亞特的方式，蘇格蘭貴族們可能早已將瑪麗·斯圖亞特處斬。能讓瑪麗·斯圖亞特知道伊麗莎白女王積極為了她的安危著想，瑟洛摩頓爵士感到十分感激，「我想那可憐的女士一定知道」。然而對那些原為英國新教同盟的人士來說，因為伊麗莎白女王的干涉，現在雙方關係降至冰點，大戰一觸即發。
儘管有引發戰爭的危險，伊麗莎白女王在只有萊斯特伯爵的支持下，依然決定要在此事件上取得勝利，因而無視瑟洛摩頓爵士與塞西爾的請求與警告，這兩人希望能與莫雷伯爵保持友善關係，同時對於伊麗莎白女王彷彿著魔般想要使蘇格蘭順從的想法，感到警覺不已。對於要求釋放瑪麗·斯圖亞特一事感到不滿，伊麗莎白女王決心盡可能地破壞莫雷伯爵建立穩定政府的努力。為了冷落莫雷伯爵，伊麗莎白女王故意召回瑟洛摩頓爵士，以展現自己不認同莫雷伯爵王權的態度。這不僅僅是個策略，但瑟洛摩頓爵士一直努力向伊麗莎白女王解釋，莫雷伯爵其實早已手握大權，而大多數的蘇格蘭人都不希望令王權蒙羞的瑪麗·斯圖亞特復辟。莫雷伯爵對伊麗莎白女王很反感，也不把她當回事，他如此告訴塞西爾：「儘管貴國女王陛下、你的女主公似乎公開地表達對現況的不滿，但我一點也不懷疑，在她心裡其實很喜歡現在的狀況。」
然而在八月十一日時，伊麗莎白女王因「頸部扭傷造成的疼痛」而大感脾氣暴躁，向塞西爾說了「十分具有攻擊性的話語」，嚴厲地斥責他與其他議員們，竟然想不到任何方法，可以協助她為蘇格蘭女王遭到囚禁一事進行報復，更無法將她救出。塞西爾說了些模稜兩可的話後，伊麗莎白女王便開始大吼大叫，表示要對蘇格蘭宣戰，要塞西爾去警告莫雷伯爵，若他與其他蘇格蘭貴族們繼續囚禁瑪麗·斯圖亞特，或膽敢威脅她的生命與安危，伊麗莎白女王將以身為統治者之名，用最強烈的手段進行報復。當塞西爾試圖為莫雷伯爵辯護時，伊麗莎白女王勃然大怒地表示，若有人能包容鄰國統治者遭到非法手段推翻，顯然對於自己國家的在位者也不抱著盡忠職守的心意。然而塞西爾不為所動，只提醒她若向蘇格蘭方面威脅宣戰，對方可能會故意處決瑪麗·斯圖亞特。
一周後，英國國務大臣塞西爾十分確定女主公並不真想與鄰國開戰，陰鬱地表示女王的所作所為，有損他過去七八年來好不容易與蘇格蘭建立的邦誼。儘管她不再表示要興戰，卻仍不斷譴責莫雷伯爵。塞西爾對她的想法瞭然於心，他知道女王並不希望讓人們認為她對表親瑪麗·斯圖亞特抱持著偏見，而且她也為自己擔心，害怕臣子膽大妄為以蘇格蘭事件為師來反抗她。到了八月二十二日，當莫雷伯爵被選為攝政議會議長時，伊麗莎白女王拒絕承認他的正當地位，也不願承認詹姆士六世為新任蘇格蘭王。一直到十月份她才冷靜下來，直面蘇格蘭情勢已無法挽回的事實。
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六月份，伊麗莎白女王派遣薩賽克斯伯爵前往維也納的哈布斯堡王朝，將嘉德勳章的殊榮獻給馬克西米連二世，並一探查爾斯大公的真面目。他送回的報告十分有幫助：查爾斯大公身材修長，留著紅棕色的頭髮與鬍髭，「臉部比例均勻，和藹可親，膚色也非常健康；他的表情與言語都使人感到愉快，謙恭有禮卻仍保有其應有的尊貴；身材比例好，沒有畸形或瑕疵；雙腳都很乾淨，比例極佳，有著能和身高匹配的粗細程度」。而且「整個人沒有什麼讓人感到不悅之處」。他能流利地使用四種語言，德文則是他的母語，他在哈布斯堡王朝非常受人崇敬，據說非常聰穎、心胸寬闊又勇敢。深諳打獵之道、騎術、縱鷹獵捕與各種戶外活動，薩賽克斯伯爵甚至大讚他的馬術。他非常聰明，教育程度極高，而且非常富有，生活在「尊榮與尊貴之中」。
兩國聯姻協商成功唯一的絆腳石就是宗教問題了，就算是為了取悅伊麗莎白女王，查爾斯大公也不願改信。只是哈布斯堡王朝君主已經準備讓步：只要伊麗莎白女王的態度軟化，讓他弟弟除了公開陪伴她參加聖公會禮拜外，可以私下參與彌撒儀式，如此一來，查爾斯大公就絕不會做出任何破壞英國國教的事情，同時也願意馬上迎娶伊麗莎白女王。到了十月，薩賽克斯伯爵寫信給伊麗莎白女王，呼籲她接受這個條件，同時私下寄給塞西爾一個紙條：「各界的看法是，若女王陛下在他的宗教爭議上不願滿足他，那就代表她絕對不想接受這件事。」
因為此事的高度爭議性，伊麗莎白女王轉向樞密院尋求意見。塞西爾與諾福克公爵都傾向接受對方的妥協，但萊斯特伯爵認為女王成婚將毀了他的一切，而北安普敦侯爵、潘布魯克伯爵與佛朗西斯·諾利斯爵士均反對。儘管知道不能再拖太久，必須給查爾斯大公一個答案，但伊麗莎白女王依然無法下定決心，幾周來，樞密院中的反對派一直抗爭，想讓女王接受他們的觀點。至於在維也納方面，讓薩賽克斯伯爵感到憤怒不已的，就是萊斯特伯爵用盡心機——「完全不討人喜歡」——破壞聯姻計劃，包括策動積極派的新教神職人員強烈反對，不讓信仰天主教的查爾斯大公接近聖壇。
最終萊斯特伯爵獲得了勝利。十二月十四日這天，伊麗莎白女王親自結束了長達八年的聯姻協商，寫信給薩賽克斯伯爵，表示讓查爾斯大公私下進行他的宗教儀式，完全違背了她的道德觀及宗教統一的政策。就算她個人答應了，英國國會也不一定會願意，在沒有國會的背書下，她絕不會一意孤行。塞西爾、諾福克公爵與薩賽克斯伯爵的希望也到此告終，而他們將令人失望的結果全都怪罪到萊斯特伯爵身上，同時也預見「伊麗莎白女王終身不婚可能帶來的損害」。哈布斯堡王朝君主也感到「震驚不已」，同時拒絕伊麗莎白女王對查爾斯大公訪英討論宗教事宜的要求——她也已經料到他會拒絕——沮喪的薩賽克斯伯爵則交出嘉德勳章，展開了返家的長途旅程。