一五六五年十一月份，萊斯特伯爵與諾福克公爵間的「大衝突」，達到史無前例的高點。兩邊派系人馬開始穿上專屬制服，萊斯特伯爵的支持者皆穿紫色，而諾福克公爵與薩賽克斯伯爵陣營則以黃色為主。這些派系中的新血，都傾向訴諸暴力與叫囂來解決分歧，兩邊陣營的緊張情勢一度危急，讓薩賽克斯伯爵向女王投訴他的太太有生命危險。
伊麗莎白女王非常清楚，自己對萊斯特伯爵的偏袒，就是這些麻煩事的問題根源，然而萊斯特伯爵甚至吹噓自己是個「有女王陛下撐腰，便什麼也不用倚靠的男人」，讓事情更加惡化。女王曾在謁見室中公開警告他，要他不要表現得與女王太過親近，招致妒忌，盼能化解紛爭。
這次她親自擔任這些派系之間的協調者，堅持要雙方放下爭執。亨利·西得尼爵士從愛爾蘭寫信給萊斯特伯爵：「聽說您最近做出極大退讓。」但他卻同時煽風點火：「也許您與對方能裝作表面和諧，但在確定之前別輕易相信，因為這樣的信任通常都會帶來背叛。」宮廷中許多人也有相同的看法，在雙方謙恭有禮的虛假外表下嗅到火藥味。
是月，德·富瓦大使發現，萊斯特伯爵依然瘋狂追求女王，而萊斯特伯爵的對手們也感覺與他假裝友好非常容易。諾福克公爵卻是唯一的例外。
十二月初，諾福克公爵覲見女王，他趁這次機會大大鼓吹婚姻的好處，以及穩定繼位問題帶來的利益。他向伊麗莎白女王表示，英國宮廷中多數有權的臣子都希望她嫁給查爾斯大公。若有人支持女王與萊斯特伯爵成婚，也是因為他們認為這是女王心之所向，「絕不是因為他們認為這段婚姻能為英國帶來任何利益，或對女王的尊嚴有任何幫助」。伊麗莎白女王一直以禮貌的態度聆聽諾福克公爵的說法，但卻拒絕說出任何確定的答案，接著她答應了諾福克公爵退下的請求，這次的會面才結束。
很快，在那之後，諾福克公爵去找萊斯特伯爵，並警告他別忘記自己前一年夏天允諾過放棄對女王的追求。萊斯特伯爵非常克制地不與他發生齟齬，諾福克公爵接著帶著自己為王權與國家爭一口氣的驕傲返家。
這一年的聖誕節，萊斯特伯爵信心滿滿地，再一次請求女王嫁給他。女王一如往常地回以模稜兩可的話，故意要他等到二月份的聖燭節才有答案，但接下來幾天，女王似乎非常認真地思考他的求婚。宮廷中流言滿天飛，而萊斯特伯爵則大大利用了他成為親王的可能性，在這段時間內樹立了更多敵人。德·富瓦大使則私下向唐迪亞哥大使發誓，「女王在新年之夜一定與萊斯特伯爵上床了」，但唐迪亞哥大使並未完全採信他的說法，認定這是他居心叵測想要踐踏女王的貞操，破壞女王與哈布斯堡王朝聯姻的機會。
在主顯節時，因為希尼治爵士被選為「第十二夜國王」，整夜都將由他來主持宮廷宴席，因此萊斯特伯爵與他爆發了新一輪的衝突。在進行一個益智遊戲的時候，希尼治爵士逼迫萊斯特伯爵問女王，心裡最難消除的是什麼？——是妒忌還是惡意搬弄是非的人散播的邪惡想法。
「羅伯特·達德利伯爵因為不便拒絕，只好服從。女王禮貌性地表示兩者都很難消除，但對她個人來說，妒忌更是難以抹去的情緒。」萊斯特伯爵以為這句話是衝著他來的，女王故意暗示萊斯特伯爵對她不忠，於是萊斯特伯爵給了希尼治爵士一個口信，表示因為他無理的舉動，將「用棍棒來懲戒他」。希尼治爵士於是反駁：「這樣的懲戒一點也不公平，若羅伯特·達德利伯爵冒犯了他，將會嘗到他的劍有多利。但羅伯特·達德利伯爵卻只回答，希尼治爵士不是他的對手，因此他會把懲戒的時間，延後到他認為適當的時機。」法國大使表示，希尼治爵士向女王告了狀，讓女王對萊斯特伯爵感到氣惱不已，甚至向他發飆，「若因為她的寵愛，讓他變得如此傲慢無禮，他應該盡快改正態度，否則女王能提拔他也能貶謫他」。「陷入憂愁」的萊斯特伯爵，接下來幾天都關在房裡足不出戶，他這樣的舉動達成了預期的效果，讓女王的怒氣很快就變成了原諒。很快，威尼斯方面就出現了相關傳聞，指出伊麗莎白女王想冊封他為公爵，並嫁給他。聖燭節來了又走，女王這邊卻杳無音訊，很快大家就明白，伊麗莎白女王只是又使了她最著名的一招——拖延戰術。
諾福克公爵依然決心要將萊斯特伯爵斗倒。表面上，兩人都盡心盡力地想要維持友好，但兩人彼此之間的憎意依然十分明顯。因此當法國國王出於對嘉德勳章的感謝，準備要授予伊麗莎白女王的兩位臣子聖米迦勒勳章殊榮，並且人選由她決定時，她提名了萊斯特伯爵與諾福克公爵，典禮時間就定在一月二十四日。
諾福克公爵怨恨萊斯特伯爵得到的一切榮耀，於是拒絕參加，經過女王多方說服才讓他答應出席。典禮當天，諾福克公爵與萊斯特伯爵穿上了白色與黃褐色的天鵝絨禮袍，裝飾著金色與銀色蕾絲緄邊，兩人先在懷特霍爾宮的「大議事廳」等待，接著才前往進行授勳儀式的禮拜堂。在兩人禮貌周到的外表下，憎恨的情緒已到達沸點。女王對此授勳儀式也意興闌珊。在法國方面將這個勳章贈予達恩裡勳爵後，女王便發現聖米迦勒勳章如此浮濫地發給了太多人，也降低了聖米迦勒勳章本身的價值。
典禮過後不久，諾福克公爵從塞西爾處聽聞女王的寵臣完全忽視自己的諾言，依然持續追求行動，諾福克公爵於是去找萊斯特伯爵，堅持要他放棄任何一丁點兒想要娶女王的意圖。除此之外，更重要的是，他必須支持哈布斯堡王朝的聯姻計劃。萊斯特伯爵同意盡可能地幫忙，但前提是不能讓伊麗莎白女王覺得自己不喜歡她，這樣她可能會「發女人脾氣，毀滅他」。他非常信守承諾，真的跑到女王跟前，要求女王為了自己也為了國家著想趕快結婚，當然也可以阻止別人繼續誣賴他阻擋女王的婚姻之路。
不久之後，伊麗莎白女王在一次與唐迪亞哥大使在懷特霍爾宮的私人花園散步時，因為萊斯特伯爵無私地要伊麗莎白女王為了英國盡快結婚而向大使出言盛讚。事實上，阻擋女王婚姻之路的，並不是她對萊斯特伯爵的私情，而是哈布斯堡王朝君主不答應她的條件。一月份，當馬克西米連二世要求她放鬆條件時，她依然緊守底線，表示若自己嫁給一個不同信仰的男人，將會造成「千千萬萬個麻煩事」。
萊斯特伯爵真正的感受隨後也浮出檯面，當伊麗莎白女王沉醉在與歐蒙德伯爵的調情之中時，萊斯特伯爵生氣了。他與女王吵了一架，什麼目的也沒達成，憤而離宮。諾福克公爵也離開了，一直在鄉間待到九月。
萊斯特伯爵受夠了。他厭倦了衝突與詭計，同時對於自己因女王不婚而遭到的指控感到鬱悶。人們以為他大大地影響了女王的決定，但其實根本不是。他成為政府運作失當的代罪羔羊，但政府運作成功時的歸勞都歸功於女王，與他無關。在他離宮的那段時間，塞西爾與瑟洛摩頓爵士，為他提供國家與宮廷內許多情報，他向塞西爾透露自己對於女王能好好結婚，一點也不抱希望；瑟洛摩頓爵士則建議他遠離宮廷，以免成為眾矢之的。他的確沒有回宮的打算，對女王的脾氣及女王要他演出的累人的追求戲碼也都倒盡了胃口。
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一五六六年二月，達恩裡勳爵聽聞裡奇歐總待在瑪麗·斯圖亞特房中，和她進行「秘密活動」，而且還可能是她腹中那未出世的孩子的父親（這個傳聞到了十七世紀初期依然廣為流傳），再也受不了太太背叛自己的所有傳言；同時他也不想再忍受作個無實權的國王。於是他向身邊的人清楚表明，自己除了得到執政王權之外，什麼也不要，若有人能協助他成功達成目標，他就會竭盡所能地協助蘇格蘭新教。對於那些肆無忌憚的蘇格蘭領主們而言，他們一致地討厭裡奇歐秘書的影響力，希望他和達恩裡勳爵遠離蘇格蘭政治圈，而這個提議正好讓達恩裡勳爵如同待宰的羔羊。看來年老體衰的拉斯文勳爵帕特裡克（Patrick，Lord Ruthven）與摩頓伯爵（Earl of Morton）是主要共謀，但許多證據強烈顯示他們只是掛名，來掩護背後流亡的莫雷伯爵與反叛軍的行動，而後者正暗中蟄伏，希望能重新站上權力的浪頭。
這些共謀的人決定在蘇格蘭女王的面前刺殺裡奇歐：他們知道瑪麗·斯圖亞特已經懷孕六個月，從而希望能因而傷害她與未出世的孩子，讓她變得無生育能力。在領主們表面上的支持下，達恩裡勳爵便開始妄想自己被立為親王，或者萬一瑪麗·斯圖亞特死於生產過程，他就能成為攝政王，甚至取而代之坐上王位。無論瑪麗·斯圖亞特未來命運如何，他都認為自己將在蘇格蘭稱王，就算她身心健全地在政變中存活下來，胎兒也未受傷害，叛黨們表示，可以隨達恩裡勳爵高興，將瑪麗·斯圖亞特囚禁在史特林城堡中。
但達恩裡勳爵的同黨們有其他的計劃。他們想在時機確定的時候，演一齣戲給瑪麗·斯圖亞特看，讓她以為達恩裡勳爵獨自策劃謀殺裡奇歐的計劃，而且還試圖想要傷害她，以煽動瑪麗·斯圖亞特判他叛國罪——最終將處以極刑。這一石二鳥之計，將為他們一次除掉兩個不受歡迎的眼中釘。
托馬斯·倫道夫在蘇格蘭宮廷中聽到消息，於是在二月十三日通知了萊斯特伯爵：
我非常確定，現在的蘇格蘭女王對這場婚姻感到後悔莫及，她徹頭徹尾地痛恨她的丈夫。我也知道，若宮廷中的謀反計劃真的進行順利，在女王丈夫的同意下，戴維·裡奇歐十天內便會人頭落地。更多令人悲痛的骯髒事，不斷傳進我耳裡——甚至還有對付蘇格蘭女王本人的計劃。
萊斯特伯爵並不想如實回報。儘管如此，塞西爾與英國樞密院也已經發現這個謀刺計劃，也猜測出蘇格蘭女王將遭受的傷害。但一直到叛黨行動之後，伊麗莎白女王才知道：三月六日，倫道夫便要求塞西爾通知女王謀反計劃，但他的信件並未及時送達倫敦。
叛黨們原定於三月十二日進行謀刺計劃，但因擔心倫道夫背叛他們，因而提前三天行動，以免伊麗莎白女王插手阻攔。一五六六年三月九日，拉斯文勳爵帶著一批持械男子進入荷裡路德宮，這時懷孕六個月的蘇格蘭女王瑪麗·斯圖亞特與阿蓋爾小姐和裡奇歐正在用膳，裡奇歐雖身在女王面前，卻並未依照禮俗脫下帽子。突然間達恩裡勳爵、手持武器的拉斯文勳爵和一群人闖入房裡，將女王推向一邊，抓住了意大利籍的秘書裡奇歐，裡奇歐隨即大喊：「侍衛！侍衛！快救我，我的夫人！」同時一手抓住了瑪麗·斯圖亞特的裙擺。持械男子將他拉開，接著他被拖進隔壁房間，被以殘忍野蠻的手段謀殺了，死時身上有五十六處刀傷。瑪麗·斯圖亞特被人強行壓制以免她前去營救，後來她表示其中一名叛黨，拿著上膛的手槍對著她隆起的肚子。當她詢問達恩裡勳爵為何做出「如此缺德的骯髒事」時，他破口回罵表示「這兩個多月來，她陪伴戴維的時間比陪他還多」。
在震驚之中，蘇格蘭女王瑪麗·斯圖亞特被幽禁在房中，但接下來的兩天內，她設法說服了她那不太聰明的丈夫，這群叛黨接下來要謀殺的目標就是他。達恩裡勳爵被嚇得驚慌失措，背叛了所有參與謀刺計劃的叛黨人士，瑪麗·斯圖亞特隨即明瞭，這場反叛行動真正的目標是她。三月十一日子夜，蘇格蘭女王夫婦從後方的階梯悄悄離開，穿過僕人們的住處逃離了皇宮，跨上馬，飛也似的在夜裡穿梭了二十五英里，終於抵達敦巴。
蘇格蘭女王在敦巴決定為裡奇歐之死復仇，於是召集了八千人的軍隊反攻愛丁堡，終於在三月十八日重新奪回首都控制權。然而叛黨們早已逃離愛丁堡，並且熱血沸騰地準備報復達恩裡勳爵的背信棄義。不久之後，瑪麗·斯圖亞特便發現達恩裡勳爵涉入裡奇歐之死的程度甚深，夫妻兩人之間的短暫的和解至此戛然而止。兩人的感情至此破裂，瑪麗·斯圖亞特將達恩裡勳爵排除在所有政務之外。儘管他仍住在宮中，但總被視為一個乖戾慍怒又危險的麻煩人物，而且持續受到監管，以免他又涉入任何陰謀中。
當瑪麗·斯圖亞特從敦巴寄出一封充滿情緒與畫面的信件，通知伊麗莎白女王裡奇歐之死與達恩裡勳爵涉案的情事時，伊麗莎白女王對瑪麗·斯圖亞特遭受的一切磨難，感到十分驚恐。伊麗莎白女王將瑪麗·斯圖亞特的一幅縮小畫像掛在腰間，召見了唐迪亞哥大使，花了整整一個小時與他討論這件邪惡的事情，她告訴唐迪亞哥大使：「若我是瑪麗·斯圖亞特，我一定會拿起丈夫手中的那把劍刺向他。」她隨即想起自己談論此事的對象是唐迪亞哥大使，於是很快地加上一句，自己絕對不會這樣對待查爾斯大公。
返回愛丁堡後，瑪麗·斯圖亞特發現莫雷伯爵表示願意協助她。她在危險中的表現讓莫雷伯爵大為激賞，莫雷伯爵花了一番工夫說服她，自己站在她那一邊。她讓莫雷伯爵重回議事廳堂，在她懷孕後期，莫雷伯爵漸漸地成為蘇格蘭實際上的統治者，也讓自己能與伊麗莎白女王匹配。蘇格蘭貴族們不想再與達恩裡勳爵囉唆，毫不掩飾他們對他的輕視。
蘇格蘭發生的恐怖事件，讓伊麗莎白女王為瑪麗·斯圖亞特感到十分憂心，於是要她放下雙方歧異，因此有一段時間，兩位女王間的關係大有進展。兩位表親再度魚雁往返了一段時間，伊麗莎白女王扮演較年長、較有智慧的姐姐角色，提供許多寶貴意見，同時也為瑪麗·斯圖亞特祈禱，希望她生產時經歷短暫痛苦獲得甜美果實。「我，」她表示，「也『懷著』極大的期待，盼望聽到好消息。」瑪麗·斯圖亞特充滿感激之情，於是獻給伊麗莎白女王一個最大的榮耀，詢問她是否願意當孩子的教母。
瑪麗·斯圖亞特對這位「最親愛的姐妹」如此努力促成她的願望十分感激，英國王位繼承問題的緊張情勢，似乎也減緩不少。在瑪麗·斯圖亞特的眼裡，查爾斯大公是最適合表姑的配偶人選，於是熱切地為聯姻計劃背書。
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伊麗莎白女王與萊斯特伯爵的冷戰只維持了兩星期：一如往常，女王無法忍受沒有他的生活，到了三月底，因為「討厭」他不在的日子，女王派了一位侍女桃樂絲太太，前去告訴他：「你那輕率的舉動影響了她，女王陛下因你長時間不在而變得苛刻。」四月一日，萊斯特伯爵便重返宮廷，在伊麗莎白女王表示再也不讓他離開自己身邊後，兩人再度和好。
塞西爾暗自說服自己，要讓女王對寵臣的感情順其自然，他努力調整心情，接受女王可能嫁給萊斯特伯爵的結果，但他自然對這樣的發展不太滿意，不只是他的個人因素，還因為他深深相信，兩人成婚無法為英國帶來任何益處。四月份時，他著手製作了一張圖表，將萊斯特伯爵與查爾斯大公做比較，在每一個評比的項目中，萊斯特伯爵幾乎都輸：他出身平凡家庭，在「財富、受人敬重的程度與權力」上，他樣樣都無法為這段婚姻加分；他與前妻並未生子，他可能也無法生育。這可能是「一段充滿色慾的婚姻」，這樣的婚姻始於放蕩將終於傷痛。查爾斯大公「受人尊崇」，而萊斯特伯爵則「受許多人唾棄，還因前妻之死蒙羞」。若他娶了伊麗莎白女王，「世人將認為有關伊麗莎白女王與萊斯特伯爵之間的流言蜚語都是真的」。
就如以往在信件中的堅決般，塞西爾總認為這些流言是錯誤的；他也深信，時間一久，伊麗莎白女王將會接受與哈布斯堡王朝的聯姻，他總是在心中祈禱，神會將她的心導向這個方向，否則她統治之下的英國將充滿麻煩、不平靜。
然而萊斯特伯爵並未在宮中待太久。他與女王之間依然冷淡，傳聞甚至指出，女王打算免去他騎士統領之職責。到了四月底，女王讓萊斯特伯爵前往諾福克郡的莊園，但萊斯特伯爵這次的離開，並未獲得女王的善意對待，女王寫了一些尖酸刻薄的責難，但相關證據至今已蕩然無存。震驚不已的萊斯特伯爵轉而告訴瑟洛摩頓爵士：
我收到了你（的信件）和另一封向來能帶給我極大安慰的信，但現在我也不知道該如何區分這些音訊。若能在我身上找到任何起因，便是我活該，我願面對更糟的懲罰，然而沒有任何人能堅持像我一樣離錯誤如此遙遠，我非常清楚，自己絕無犯錯：我從未刻意冒犯。人總會犯錯；我只希望那唯一最重要的人能原諒——是的，遺忘——我。若長久以來的服侍與多年的表現，仍不能證明堅定不移的忠誠，我又該如何相信過去的這些寵信，一時的錯誤就毀去了過去建立的一切嗎？
他實在太過沮喪，甚至表示：「我現在只想蜷縮在一個被遺忘的洞穴角落，或可以長眠的墳墓中。」
女王再一次將他召回宮中，他不耐煩地回去，但女王想與他和解，不久後，他又再度回到最受寵的位置。
五月份，伊麗莎白女王總算同意，派遣塞西爾的妻舅湯瑪士·丹奈特（Thomas Dannett）前去奧格斯堡與哈布斯堡王朝君主斡旋，女王表示若哈布斯堡王朝君主同意讓查爾斯大公訪英，他與女王之間的婚姻協商，就再也沒有任何阻撓。然而馬克西米連二世依然執著於宗教問題，於是原本計劃贈予其嘉德勳章的伊麗莎白女王，決定在對方態度軟化前延後贈予計劃。
丹奈特特使也在維也納見到查爾斯大公本人，並向女王回報大公本人慇勤有禮、友善可親、變通不守舊、博學多聞、十分得人心，也非常喜歡戶外運動；曾得過天花而倖存，但天花並未減損他的帥氣。「身為一個男人」，他顯得「十分俊俏，長相好看，體格健美，腰圍小，胸圍寬闊；儘管穿著全副服裝，依然看得出大腿與小腿比例完美」。儘管「有一點傴僂」，他騎馬時依然挺拔。唯一的缺點是對宗教信仰虔誠，可能永遠也不會改變自己的信仰。丹奈特特使希望女王對查爾斯大公私下參與彌撒儀式「睜一隻眼閉一隻眼」，但女王卻固執地拒絕了。丹奈特特使一直在奧地利待到八月，徒勞地等待女王改變心意，但他卻只等到女王要一張畫像的要求。
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六月十九日，在戒備森嚴的愛丁堡城堡中，蘇格蘭女王瑪麗·斯圖亞特經過漫長又痛苦的生產過程，終於產下一個健康的男嬰詹姆士，也大幅增加了她繼承英國王位的可能性。從此她對英國王位的企圖，不再只是為了自己，還為了她的兒子。
數十年後，詹姆士·梅爾維爾爵士的回憶錄引用了一個來源不明的故事，指出伊麗莎白女王對詹姆士出世的反應。對於當時的她，梅爾維爾爵士表示：「展現出極大的歡樂之情，在晚膳後開心跳舞。」六月二十三日，當塞西爾悄悄地告訴她這個消息，「聽聞消息後，她悲愴地跌坐，猛然對著侍女們大喊，蘇格蘭女王已經是個男孩的媽了，而她卻只是個不會下蛋的母雞」。但梅爾維爾爵士並未親眼見證此事，僅表示自己是聽聞宮廷中的朋友轉述，但當時他卻未記錄下來，現代也未有當時留存下來的相關證據以資證明。而梅爾維爾爵士向瑪麗·斯圖亞特轉述伊麗莎白女王的反應時，僅表示王子的誕生「讓女王陛下感激不已」。事實上，在梅爾維爾爵士抵達之前，塞西爾便已先行告知女王此消息，而唐迪亞哥大使則稱：「女王對於新生兒的誕生顯得相當高興。」