一五八三年十一月，佛朗西斯·瑟洛摩頓在倫敦家中就逮，在他家中搜出各種「罪大惡極的宣傳手冊」、天主教鬼子名單，以及他國船艦能順利入侵的港灣記錄。更令人感到不祥的是，門多薩大使顯然涉入這些陰謀極深，這讓沃爾辛厄姆爵士感到相當詫異，因為他懷疑的對象主要聚焦在法國大使身上，但若法國大使早知這些陰謀，可能早就避開以免受牽連。
儘管在倫敦塔中遭到刑求，瑟洛摩頓仍不願吐露實情，但在女王下令二度施行肢刑後，他的勇氣盡失。「現在我被迫吐露她的秘密，這對我來說是世界上最珍貴的東西。」他悲歎道。他透露這些陰謀背後主要的目的就是菲利普國王「對英國的企圖」，其主要目的就是讓瑪麗·斯圖亞特成為英國女王。羅馬教皇、吉斯家族與耶穌會都涉入此案，計劃分四波攻擊進行，主要戰場為蘇格蘭、愛爾蘭、薩賽克斯與諾福克，而參與起義的則為英國與歐洲各地的天主教徒。計劃進行得相當完整，只剩在英國發起叛亂行動。瑪麗·斯圖亞特與門多薩大使，都全力參與計劃每個階段的執行，但沃爾辛厄姆爵士在監視瑪麗·斯圖亞特的通信中，早已猜到瑪麗·斯圖亞特在搞鬼，因為她在多封信件中都漏了口風。
「相關事證顯示，她想要騙我們放鬆戒心，」伊麗莎白女王做出此結論，「這樣我們就不會發現他們在英國境內與歐洲各國的陰謀詭計。」
英國政府認定這是一個相當危險的謀反行動，因此主動出擊，捉拿瑟洛摩頓名單中的幾位天主教貴族。有些人被關進倫敦塔，有些人聽到風聲已經逃竄海外。這回因為有足夠的證據定罪，因此宮廷人士堅決要求女王將瑪麗·斯圖亞特繩之以法，但卻遭到女王斷然拒絕。但她同意在泰伯恩行刑場處決瑟洛摩頓，並將門多薩大使驅逐出英國。門多薩大使臨別前的最後一擊，表示他的主公將會以戰爭報復這樣的屈辱。但一直到伊麗莎白女王卸任前，西班牙都未再派遣任何一位大使前來英國。
英國國會與樞密院都想採取軍事行動，欲以強烈的行動來保護女王，並呼籲女王盡快對瑪麗·斯圖亞特採取「最後」的手段。但女王依然猶豫不前，而這次萊斯特伯爵也站在她那一邊，他提議將繼續以尊榮高貴的方式囚禁瑪麗·斯圖亞特，這樣的策略是為了英國的利益，若有一天瑪麗·斯圖亞特真的登上英國王位，她也會記得自己的命是誰給的。但在其他人都想要瑪麗·斯圖亞特的項上人頭之際，這個意見顯得相當孤單。
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一五八四年六月十日，安茹公爵因一場高燒在法國沙托特裡逝世。安茹公爵之死意味著法國王位已經沒有瓦洛王朝的血脈來繼承，法王亨利三世膝下無子，法國王位只好傳承給他的一位表親，納瓦拉的胡格諾教派領袖亨利·德·波旁（Henry of Bourbon）。
安茹公爵的死訊傳來時，伊麗莎白女王顯然陷入哀傷，整整三周，幾乎天天都在公開場合中哭泣，讓旁觀者都明瞭，她對她的「小青蛙」感到相當不捨。英國宮廷也被迫為安茹公爵哀悼，伊麗莎白女王甚至身穿黑色服裝悼念了長達六個月。「宮廷氣氛一片憂傷，」沃爾辛厄姆爵士這樣告訴一位朋友，「許多公開與私下的因素，讓我們一整季神傷。」
伊麗莎白女王則寫信慰問凱瑟琳·梅迪奇：
儘管您是安茹公爵的母親，但我的哀傷並不遜於您。您還有其他孩子得以寄托，但我卻毫無其他慰藉，此生無緣再見，只盼死後我能與他重逢。夫人，若您能看進我的心坎裡，便能看見一個沒有靈魂的軀殼，然而您有太多沉重負荷，我不想再以哀傷令您煩憂。
但並非所有人都認可她的誠意。當伊麗莎白女王向法國大使表示「我是個喪夫的寡婦」時，法國大使直指她是一個「非常懂得依照時勢所趨調整自己的君主」。
此時傳出了更糟糕的消息。奧蘭治親王威廉一世於七月十日在台夫特慘遭暗殺一事，震驚了歐洲各地的新教團體。這起暗殺事件背後的主謀，顯然就是菲利普國王，此事對伊麗莎白女王來說代表著不祥，英國臣民們都相當擔心她會是下一個受害者。現在，伊麗莎白女王與帕爾瑪公爵的軍隊在尼德蘭的對壘已經毫無阻礙，因為氣勢衰退的法王亨利三世正忙著處理宮廷中的派系問題，避免派系鬥爭白熱化，而安茹公爵又已不幸去世。帕爾瑪公爵的軍隊逐漸獲得優勢，拿下了一個又一個城池；伊麗莎白女王則認為，只要西班牙成功征服尼德蘭，到時若找不出任何領袖來接替奧蘭治親王威廉一世的位子，菲利普國王接著就會放眼英國。因此，打壓蘇格蘭女王不軌的舉動有其迫切性。
瑪麗·斯圖亞特現已四十二歲，十六年的禁錮生涯，早已侵蝕了她原有的美麗與健康情形。她的頭髮變得灰白，體態臃腫，同時為風濕病與身體的慢性疼痛所擾。儘管英國政府多次同意讓她前往巴克斯頓做礦泉治療，但她的狀況卻一點也沒有改善。
一五八四年，瑪麗·斯圖亞特主要居住在謝菲爾德城堡，在士魯斯柏立侯爵的看守下生活。但偶爾當謝菲爾德城堡要進行清潔工作時，她就會住在士魯斯柏立侯爵的其他住所。士魯斯柏立侯爵負責審查她所有的通信內容，每當她在許可的狀態下出外透透氣，侯爵都會派遣一整隊的守衛陪伴著她。事實上，無論城堡內外，瑪麗·斯圖亞特的身邊都是守衛，到了夜間，甚至連附近的城鎮與鄉村都有守夜人。任何想要進入城堡外圍地區的人，都必須回答自己來訪的目的；若沒有得到樞密院書面批准，任何人都不得進入城堡，也不得與瑪麗·斯圖亞特交談。若她要接見訪客，也都有人隨時在一旁監視。
瑪麗·斯圖亞特非常痛恨這些限制，但她仍保有女王般的尊榮。她的家眷約有四十八人，此外還能挑選僕人，並給付僕人薪資、她的飲食與燃料所需的費用，儘管每年將近一千英鎊，但伊麗莎白女王全都買單，她甚至可以在君主專用的頂篷下用餐，每次用餐時都能享用正式的兩道菜餐點，而每道菜都有十六種選擇之多。她也得以享受打獵的樂趣，但她的風濕病常常讓她無法盡情享樂；因此她便與侍女們一同作精緻刺繡手工，或是逗弄她身邊許多賞玩用的小狗與鳥兒。她曾向友人表示，這一生除非成為英國女王，否則她可能都無緣踏出這囚錮她的大牢，因此儘管風險極高，她仍一而再再而三地想要達到目的，無視於嚴格監督著她的所有眼光。幾年過去了，她與英國境外友人的通信越來越困難，這時的她只能仰賴願意幫她突破沃爾辛厄姆爵士鋪天蓋地嚴密檢查的家僕。
一五八四年八月，沃爾辛厄姆爵士決定加強瑪麗·斯圖亞特身邊的安全檢查；士魯斯柏立侯爵承擔看守瑪麗·斯圖亞特的重大責任多年，開始傾向對她仁慈寬大，現在，看守瑪麗·斯圖亞特的工作偶爾也會由拉爾夫·賽德勒爵士（Sir Ralph Sadler）進行。隔月，沃爾辛厄姆爵士出示一封信給伊麗莎白女王看，證明她的表侄女依然密謀要推翻她，瑪麗·斯圖亞特因而從謝菲爾德移監前往斯塔福德郡的溫菲德，到了一五八五年一月，再度被關進那令人望之生畏的特伯利城堡。在那裡要出外打獵的可能性變小了，她要請人挾帶信件也更加困難。儘管她對此大加抗議，並抱怨特伯利城堡又濕又冷，但她依然能維持生活水平，且歷史證據也顯示，英國政府提供了相當充足的飲食與燃料。當然也有人直截了當地告訴她，因為蘇格蘭的生活水平遠低於英格蘭，因此「當她身在自己的國家時，絕不可能接受如此高規格的款待」。
但這一切也無法確保伊麗莎白女王的安全。一五八四年秋天，憂慮的聲浪讓英國境內的士紳貴族全都動員起來，採取更嚴格的預防措施以對抗英國王權受到的威脅。一名耶穌會神父克雷頓遭到荷蘭政府逮捕，他身上帶著一份文件，詳細記載了菲利普國王那惡名昭彰的「對英國的企圖」，讓英方的敏感神經與憤慨頓時爆發。
萊斯特伯爵提議組成一支新教衛士聯盟，這些人必須宣誓必要時願意以女王之名拋頭顱灑熱血；若蘇格蘭女王涉及謀反欲取伊麗莎白女王的性命時，就算是偷偷摸摸的地下運作，都必須摧毀掉她。此舉得到樞密院許多參事支持，傳言女王可能也相當支持，只是她隨後否認。這個誓言被稱為聯盟誓約。這一年十月，當英國政府將這個行動公之於世時，完全擊中了社會大眾的憂慮，在全國各地得到上千名衛士的熱烈迴響，他們紛紛加入衛士聯盟並大膽宣誓。他們完全不在乎是否會冒犯到信仰天主教的鄰人，大聲宣告寧願面對內戰也不願接受天主教鬼子當他們的君主。在伯利男爵的教唆下，有人將聯盟誓約讓瑪麗·斯圖亞特過目，以此舉清楚地向她表明，若她繼續挑釁，她的性命可能會受到重大危機。
瑪麗·斯圖亞特在罪證確鑿的狀態下，表示自己對推翻伊麗莎白女王的任何陰謀都不知情，甚至在聯盟誓約上簽下了自己的名字；兩天內，她便著手撰寫了一封信件給西班牙菲利普國王，要他盡快將「對英國的企圖」付諸實踐，就算要她賠上性命也無所謂。
伊麗莎白女王對自身安危相當不重視，甚至到了令人掛慮的地步，而宮中的男性參事們對她那猶豫不決的女性特質感到相當疼惜；他們為了捍衛她的利益，甘願不惜犧牲性命。儘管臣民上下一心地對她展現忠誠與情感，讓她感動不已，但她仍不願輕易允許所謂的私刑制度，只表示她絕不會輕易地「為了某一個人的錯」把另一人殺死，也不願意允許任何可能影響臣民道德良知的法條。英國國會也有相同的看法，堅持在通過成為法律之前，聯盟誓約必須先行修正。從今以後，任何密謀叛國的「不法之徒」，在「面對極刑」之前，都必須先經過審判。
為了避免新法上路後，瑪麗·斯圖亞特可能要面對審判的窘境，伊麗莎白女王再度嘗試與詹姆士六世溝通，盼望他願意與母親權力共享。然而儘管蘇格蘭王詹姆士六世積極想要與英國結盟，但他仍清楚表明自己並不希望母親回到蘇格蘭來製造麻煩。伊麗莎白女王這才發現，對於詹姆士六世的背叛，瑪麗·斯圖亞特被蒙在鼓裡好幾個月。
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十月份，一本名為《萊斯特國協》的冊子，惡意地攻擊了萊斯特伯爵，這本書四處流傳散佈，內容重複敘述著過去到現在，關於他的各種下流、破壞名譽的流言。冊子裡做出更嚴重的指控，直指他是個連續殺人魔、性好勒索敲詐，更是個不折不扣的罪犯。這本冊子嚴重地扼殺了他的人格，而且撰寫得相當出色，讓許多人都相信了它的真實性。萊斯特伯爵向來不是受歡迎的人物，在這個事件當中，僅有的站出來為他說話的人，就是菲利普·西得尼爵士與伊麗莎白女王。伊麗莎白女王下令查禁這本手冊，並宣稱「只有惡魔」才會相信這些惡意的謊言，並寫信給倫敦市長，大讚萊斯特伯爵「對國家的服務、對宗教的忠貞與其他可靠的行事風格」。
幾乎可以確定《萊斯特國協》是耶穌會的傑作，在安特衛普或巴黎印製，但這本冊子與過去其他的冊子不一樣的是，書中含有近乎真實的許多細節，也因此增加了它的可信度。許多人都認為，書中內容的真實性，就是它遭查禁的主因。這些杜撰的故事流傳了將近三個世紀，這段時間，萊斯特伯爵一直受到多數史學家的詆毀，被形容成無恥的冒險家與弒妻兇手，一直到了近代，《萊斯特國協》中的瑕疵才被正式揭露，為萊斯特這個女王的忠僕平反。
因為他試圖讓兒子[1]與雅貝拉·史都華結婚，因此，萊斯特伯爵的敵人們也質疑，透過這個舉動，他是否想要重蹈覆轍，製造與父親護國公諾森伯蘭公爵與珍·格雷小姐一樣的陰謀。瑪麗·斯圖亞特認定，哈維克的貝絲小姐策劃「孫女雅貝拉成為英國王位繼承人」一事，簡直是「徒勞無功」，同時寫信要求法國大使，確保伊麗莎白女王瞭解這個情形。然而萊斯特伯爵卻說服女王，他讓兩人成婚最主要的目的，只是鞏固英國與雅貝拉的表哥詹姆士六世之間的關係。
此時，萊斯特伯爵與伊麗莎白女王之間的關係，已經達到新的境界，兩人不再互相認定為愛侶，也不再交換書信訴情衷，而是以老朋友的姿態相稱，長達四分之一個世紀的共同生活與情感，維繫著兩人。宗教也是兩人的共通點之一，也是萊斯特伯爵寫給女王的許多信件中的主題，包括這一封他於一五八三年寫給女王的信：
衷心感謝陛下親切的問候。您可憐的「眼睛」除了向神祈禱外，別無報答之法，盼神能永遠保您平安、健康與喜樂。因為神的仁慈，親愛的陛下，讓您避開許多惡意的侵害。女王陛下維持並建立了神眼中真正的宗教，抵禦各種人為的手段與詭計，因此我們看到神賜予您的恩典。願神祐您有披荊斬棘、乘風破浪之勢。
他們兩人依然有時爭吵，一次萊斯特伯爵告訴海登爵士自己不參加樞密院會，因為「這麼多雙眼睛都看到，從女王陛下口中公開吐出，是我畢生最大的恥辱」。就算經過這麼多年，女王那些帶刺的話還是能深深傷害他，但最後他總是會原諒並遺忘，不過，有時候伊麗莎白女王也會道歉。
一五八四年時，萊斯特伯爵帶著他的繼子，年僅十八歲的小艾賽克斯伯爵來到宮中，他那「討人喜歡的個性、雅致的風格、與生俱來的慇勤禮貌，幾乎隨即為他贏得女王與所有人的心」。萊斯特伯爵因此感到十分滿意，殷殷期盼小艾賽克斯伯爵能取代那討人厭的萊禮爵士在女王心目中的地位，但伊麗莎白女王還需要一點時間，才能認清小艾賽克斯伯爵不只是個俊俏、有教養的小男孩而已。
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這一年的年終時，又爆出另一個與伊麗莎白女王作對的陰謀。一位威爾士國會議員威廉·派瑞（Dr.William Parry），秘密躲在女王在裡奇蒙德宮的御花園中，企圖在她散步透透氣的時候刺殺她，但當女王現身時，他被女王莊嚴的氣勢震懾住，甚至看到她的父親亨利八世的身影，儘管他已下定決心，但他的手就是不聽使喚。
他謀殺女王背後的動機有各式各樣的傳聞：派瑞到過歐洲各地旅行，羅馬教皇必定認為他是瑪麗·斯圖亞特的代表，也是她派駐在巴黎的探子；但派瑞其實也是英國的雙面諜，秘密為伯利男爵效力，他從歐洲返國時便已事先通知伊麗莎白女王，他要演一出謀刺未遂的戲碼，以利他打入天主教鬼子的圈子中。女王賜予賞金，接著派瑞詢問一位合夥人，願不願意當那個謀刺女王的人，因此在演出謀刺未遂的戲碼前，就因行為怪異而遭人側目。他也許和前一年的約翰·索默維爾事件一樣，精神錯亂了，但在審判過程中，他仍能清楚地否認自己意圖不軌。
他謀殺女王的意圖引發反彈聲浪，英國政府方面甚至不想給予其判決前無罪的人權。「想到可能失去這麼珍貴的東西，我全身的關節都在顫抖。」一名國會議員記錄下這樣的心情。英國下議院呼籲女王讓他們執行比死刑還可怕的刑罰，來懲罰這些叛國賊，還有更多人要求將瑪麗·斯圖亞特就地正法。伊麗莎白拒絕了這兩種聲音，但到了一五八五年二月，她總算同意判處派瑞絞刑。同時英國國會通過新的法令，要求神學院教士四十天內離開英格蘭，否則就要面對通敵叛國罪名的懲罰，而沃爾辛厄姆爵士也開始著手徵召更多密探。
儘管女王向國會表達感激之意，謝謝他們「維持我生命的安全，你們的憂慮對我意義深重」，但對於英國孤立的狀態與更多意圖刺殺她的舉動，她依然不為所動。「他們想要奪我性命，」一位來自英國於一五八三年建立的殖民地紐芬蘭的代表，曾聽過女王如此表述，「但我沒什麼好害怕。主宰一切的神一直保護我到這一刻，也將會保我安康，我相信神的大能。」
她堅持不改變自己的生活方式，也不願在臣子們的殷殷期盼下，受到維安加強的限制。她和過去一樣，常常出現在民眾的眼前。當她與臣子們到鄉間漫步時，她也僅讓衛士們「帶著輕巧的武器」。她也不願聽從萊斯特伯爵的建議，禁止傾向天主教的人士進宮。這導致樞密院成員總是為她的安危感到焦慮，但同時對於她的勇氣也相當佩服。
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三月份，詹姆士六世寫信向母親表明，若要他與「被困在沙漠中」的人聯手，是絕對不可能的事情。面對兒子的背叛，瑪麗·斯圖亞特傷心欲絕，在瞭解到自己透過外交途徑協商重獲自由的希望破滅後，她也感到分外憤憤不平。
「唉！」在一封情感豐富的信件中，她向伊麗莎白女王哀訴著，「從未見過如此可惡的不孝子，身為獨子，卻剝奪母親的王權與皇室地位？」她矢言拋棄詹姆士。「在這麼多基督教國家中，我一定能找到一位有能力掌握我給予的一切的人。」為了避免表阿姨誤以為自己在打英國王位的如意算盤，蘇格蘭女王趕緊補充說明，表示「她比任何人都厭惡這些可怕的作風與恐怖的行動」。但私底下的她已經決定將她對英國王位的繼承權與野心轉給西班牙的菲利普國王。
四月份，阿米愛斯·伯勒特爵士（Sir Amyas Paulet）被指派為瑪麗·斯圖亞特的管理人，總算得以更嚴格的監督管理來限制瑪麗·斯圖亞特的各種行為。伯勒特爵士此時將近五十歲，是一位恪遵規則的人，他以強烈的清教主義觀點聞名遐邇。當瑪麗·斯圖亞特瞭解這個人的觀點時，她相當激烈地大表反對，這不只是因為他「完全沒有騎士的資格」，還因為他的容忍度比多數與她信仰同一個宗教的人都要低，阿米愛斯·伯勒特爵士在巴黎擔任大使期間，對瑪麗·斯圖亞特派駐巴黎的探子都相當嚴酷。但伊麗莎白女王選擇伯勒特爵士的原因，是他「對神相當虔敬，對我們十分忠心，可說是相當正直的人，自出生就非常高貴」。他的誠實與對君主毫不畏縮的忠誠，在擔任澤西島總督時便展露無遺，伊麗莎白女王可以完全信任與仰賴他，絕不會受到蘇格蘭女王的奸計或魅力所誘。事實證明，他是一個非常勤勉又嚴格的管理人，他的警覺一刻也不鬆懈，也從不擅離職守，對於瑪麗·斯圖亞特試圖拉攏他的舉動，維持一貫不為所動的態度。
上任後，伯勒特爵士刻不容緩地在瑪麗·斯圖亞特居住的環境中大行「嚴苛的改變」，瑪麗·斯圖亞特隨即發現，在伯勒特爵士的管理之下，她的人生將過得更加辛苦，也將與整個世界隔絕。伯勒特爵士檢查她的每一封信：什麼也逃不過他的法眼，許多外國友人寄給她的信件，在沃爾辛厄姆爵士的桌上堆積成山。伯勒特爵士不允許訪客拜訪瑪麗·斯圖亞特，並在城堡四周加強維安。瑪麗·斯圖亞特的僕人們，都不准到城牆上走動，當瑪麗·斯圖亞特出外散步時，身旁總是陪著大批重裝軍人，不讓任何當地民眾接近她。而她也不准施捨救濟品給路上的窮人，對此她認為這個規定相當沒有教養。
伯勒特爵士的安全規範只有少數漏洞，瑪麗·斯圖亞特的洗衣婦就住在鄰村，定期會來到城堡中，對於這位洗衣婦帶來的危險，伯勒特爵士似乎束手無策。除非他每次都要求這些人脫衣檢查，但對於他這麼正直的人來說，根本不可能，他無法完全確定他們沒有挾帶瑪麗·斯圖亞特的口信出去。他能做的就是嚴密監視這些人。
一五八五年時，英國與西班牙之間的關係更加惡化。五月份時，菲利普國王為了報復英國攻擊他的船隻，下令沒收停泊在西班牙港灣的所有英國船艦，成為他在里斯本的船隊組成部分。儘管不願意，但他已準備好與英國開戰，他認為這是他的神聖使命。三個月後，伊麗莎白女王在無雙宮與荷蘭簽訂協約，荷蘭成為英國唯一的盟邦。九月份時，她又指派德瑞克爵士為艦隊司令，提供一支有二十二艘船與兩千人的艦隊給他，派他出航準備佔領西班牙在加勒比海的許多一流海港。德瑞克爵士的任務非常成功：他在西班牙海岸佔領了維戈港，接著前往東印度群島，劫掠了聖多明各、古巴的哈瓦那及南美洲西班牙屬地首都卡塔赫納。