蘇格蘭女王瑪麗·斯圖亞特從一五五八年起，便認定自己是英國王位的合法繼承人；事實上她最主要的目的，就是接下英國王位能帶來的利益，因此她始終拒絕核准《愛丁堡條約》，這份條約完全斷絕她在伊麗莎白女王之後，「英國王權第二順位」的可能性。她也拒絕承認伊麗莎白為英國女王，甚至將英國軍徽用在她的部隊上。因為這些因素，一五六一年的夏天，伊麗莎白女王拒絕在瑪麗·斯圖亞特過境英國返回蘇格蘭時，給予安全通行權。女王后來隨即改變心意，但到了八月十九日，瑪麗·斯圖亞特已經從法國搭船出發抵達愛丁堡的利思港。瑪麗·斯圖亞特回到暌違二十多年的王國，在許多方面都讓伊麗莎白女王煩躁不已。除了因為她的表親在歐洲天主教派的眼中是比伊麗莎白女王更適合的女王人選，而對伊麗莎白的王朝帶來實質的威脅外，國境之北還有宗教衝突的陰影潛伏著：瑪麗·斯圖亞特告訴羅馬教皇，她想要在蘇格蘭王國內重建天主教信仰。
對個人而言，伊麗莎白女王將瑪麗·斯圖亞特視為對手：她比伊麗莎白女王年輕，據說也較為貌美；而瑪麗·斯圖亞特的寡婦身份，代表英國女王不再是歐洲貴族追求的唯一對象。歐洲各國都認定瑪麗·斯圖亞特一定會再婚，因此她的擇偶對表姑伊麗莎白女王來說，也是一大擔憂，她擔心歐洲的天主教強權進駐鄰國。最重要的是，一個覬覦英國王位的天主教徒，距離如此近，讓伊麗莎白女王感到芒刺在背。這些事情，加上兩位女性執政者之間的角力，在接下來的四分之一個世紀內，一直都是英格蘭與蘇格蘭之間關係的焦點。
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出生於一五四二年，瑪麗·斯圖亞特在出生一周內就繼承了父親詹姆士五世遺留下的王位，為了逃避亨利八世「強行逼迫」她成為兒媳婦，也就是成為後來的愛德華六世的妻子，年僅五歲的她就被送往法國，和亨利二世的孩子一起接受教育，也因此與王儲弗朗西斯（Dauphin Francis）訂了婚。童年的時光，她都在豪奢穩定的環境中成長，和表姑伊麗莎白公主的成長過程大相逕庭。
瑪麗·斯圖亞特受的教育，在許多方面都走傳統路線。她深受禮讚天主教信仰的影響，並且接受一名身家良好的女性應該要有的才藝教育與可取的知識。和伊麗莎白女王不同的是，她並不愛炫耀學識，反而喜歡弗朗索瓦·拉伯雷（Rabelais）的諷刺文學，或法國文藝復興詩人皮耶·龍薩（Ronsard）那溫文儒雅的詩句，以及拉丁與希臘沉重的文學作品。她從小就學會用法文說寫，如母語般流利，但她對意大利文、西班牙文和拉丁文只有一知半解的程度，雖然聽得懂，但卻無法書寫。當她返回蘇格蘭時，她只記得簡單的蘇格蘭文，只能與尼可拉斯·瑟洛摩頓爵士及約翰·諾克斯禮貌性地寒暄，但她仍非常努力地在語言能力上精進。儘管亨利二世想把瑪麗·斯圖亞特栽培成法國、蘇格蘭與英國未來的女王，但他一直認為讓瑪麗·斯圖亞特學英文不太恰當，因此一直到她成年後才開始正式接觸英文。
返回蘇格蘭國境中的蘇格蘭女王瑪麗·斯圖亞特，從各方面看來都是美麗優雅的法國女子，會吟誦時髦的十四行詩，也懂得精美的針線活與刺繡，而她的部分作品甚至流傳至今，她的字體也非常好看。她總是精心打扮，喜歡音樂、跳舞、芭蕾舞與舞會，同時精通馬術。
因為在法國宮廷成長的經驗，她相當世故精明。她對男人很有吸引力，這一點毋庸置疑，就連個性陰鬱乖張的約翰·諾克斯都形容她「迷倒眾生，令人銷魂」。儘管瑪麗·斯圖亞特的名聲很好，但她那天生的浪漫與衝動，使她無論多麼純潔，總是勾引著男性，也因為她對人性的判斷力不佳，後來都導致許多嚴重苦果：有些人得寸進尺，其他人則帶給她深深的傷痛。更重要的是，儘管她非常懂得運用自身魅力，就連最正直的男人也無法抵擋，但提到統治國家時，她卻認定另一半只能扮演她配偶的角色。蘇格蘭駐英大使萊星頓的威廉·梅特蘭，便曾告訴托馬斯·倫道夫，在瑪麗·斯圖亞特身上看不到伊麗莎白女王擁有的成熟判斷力與政治經驗。
在那個人類平均身高都比現在矮小的時代，身高六尺的瑪麗·斯圖亞特算是相當修長。她的體型纖細，皮膚白皙，擁有栗色的卷髮與棕色的眼睛。在她偏東方風味的臉孔上，卻有過長的鼻子，這都是父親的遺傳。舉止儀態高雅尊貴，她已經決定要成為最親民的統治者。她對朋友大方忠誠，因此下屬們都很欣賞她。
瑪麗·斯圖亞特是不屈不撓的女性，十分堅持自己的信念，也有捍衛信念的勇氣，但在政治這門藝術上，她卻缺乏實戰經驗。她常任由情緒擺佈，易受到心情變化的影響，而且也從不隱藏自己的感受。情勢發展良好時，她快樂得雀躍不已，但挫折與壓力卻容易讓她陷入憂鬱的悲傷中，一名英國大使不得不以「病態瘋狂的女人」字眼來形容她。他人不客氣的態度就能讓她瀕臨崩潰邊緣，她甚至還有多次因緊張壓力而多日臥病在床的記錄——這對許多當代人來說，都是非常怪異的行為。與伊麗莎白女王不同的是，瑪麗·斯圖亞特並不喜歡健康的體能活動，因此常常生病，而她的病因常是體側不明疼痛。但這些疾病可能都是情緒歇斯底里造成的結果。
對瑪麗來說，經歷了在法國宮廷中精緻豪奢的生活，蘇格蘭王國為她帶來不少文化衝擊。蘇格蘭位處歐洲偏遠地區，與文藝復興帶來的文明影響完全沾不上邊。蘇格蘭氣候冷冽，住在原始城堡與塔形城堡的貴族們皆未經開化、充滿暴力傾向。這裡的宗教充滿加爾文主義，儘管臣子們熱烈歡迎她返國，但不久，她便因公開在禮拜堂中聆聽的彌撒儀式中充滿「偶像崇拜」，而遭到約翰·諾克斯告誡。約翰·諾克斯的訓斥讓瑪麗·斯圖亞特因憤怒而哭泣，但他十分擔心新任女王會想要反宗教改革；然而主政派的新教人士早已準備好要容忍她的天主教傾向，畢竟在他們的眼中，伊麗莎白女王與艾倫侯爵未能成婚，無法一統英格蘭與蘇格蘭，讓他們仿如受到冷落。說起瑪麗·斯圖亞特，她其實一點兒也不瞭解蘇格蘭人民，也不知道經過與她的母親瑪麗·吉斯對抗後，人民有多麼怨恨與法國有關的一切。在多數人眼中，她其實是個外國人。
然而她願意讓步，她很快宣佈臣民在禮拜儀式中可享自由。此舉安撫了蘇格蘭國會縉紳們，迅速地，她便在這些政治人物中號召了一批支持者。
在統治蘇格蘭的前幾年，瑪麗·斯圖亞特的主要顧問，是她同父異母的哥哥詹姆士·斯圖亞特（James Stuart），一五六二年她正式冊封哥哥為莫雷伯爵（Earl of Moray）。莫雷伯爵是國王詹姆士五世眾多的私生子之一，後因進入主聖會並於一五六年主導蘇格蘭宗教改革而崛起。除此之外，莫雷伯爵甚至主動以蘇格蘭女王之名對抗約翰·諾克斯，並堅持女王可以在自己的小禮拜堂中聆聽彌撒，而他也因此得到了瑪麗的信任。此後瑪麗·斯圖亞特一直到再婚前，都以莫雷伯爵的建議來統治蘇格蘭。
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伊麗莎白女王對瑪麗·斯圖亞特有著矛盾情結：一方面將瑪麗·斯圖亞特視為危險的對手，另一方面又因為兩人都是女性執政者，還有表親關係，而認為兩人十分相似。因此，伊麗莎白女王宣佈，若瑪麗·斯圖亞特放棄爭奪英國王位，伊麗莎白女王就願意與之交好。雖然塞西爾對此大表反對，但伊麗莎白女王依然堅持要與蘇格蘭女王一會，她認為兩人面對面，就可以一起解決英國王位繼承這個令人苦惱的問題，以及《愛丁堡條約》中可能存在的誤解。
不久後，瑪麗·斯圖亞特也有了相同的想法。她有許多怨恨伊麗莎白女王的理由，畢竟伊麗莎白女王在自己的王國中，一手建立了新教霸權，但瑪麗·斯圖亞特知道，若自己與伊麗莎白女王建立彼此之間的友好關係，絕對有利無害。她始終不願核准《愛丁堡條約》，主要是因為害怕若放棄英國軍徽的使用權，可能會損害自己未來超越伊麗莎白女王的機會。莫雷伯爵與蘇格蘭領主們，一直希望她能與表姑伊麗莎白女王達成共識：只要瑪麗·斯圖亞特放棄爭奪英格蘭王位，伊麗莎白女王便可能將她預立為王位接班人作為回報。當有人將此事呈報伊麗莎白女王時，她一如往常地閃避回答，塞西爾私下則為伊麗莎白女王身後可能再有女性執政者感到萬分恐懼。
瑪麗·斯圖亞特派遣大使威廉·梅特蘭到英格蘭表達友善的問候，並詢問伊麗莎白女王是否有改變《愛丁堡條約》內容的計劃。經過一番熱情歡迎，威廉·梅特蘭完全不浪費任何時間，馬上將瑪麗·斯圖亞特是否能成為英國下一任女王事宜搬上檯面。而伊麗莎白女王明顯露出失望神色。
「我原期待著貴國女王有其他要事，」伊麗莎白女王說，「這些花言巧語我聽多了。」「不，」她繼續表示，她「並不想討論有關王位繼承問題」。
「我死了以後，誰最有合法性，就由誰來繼承王位，」她當場宣佈，「若貴國女王恰好符合這個條件，絕對不會讓她失望；若他人有更高的合法性，要我傷害這樣的合法性，一點也不合理。」雖然她勉強承認自己並不知道有誰比瑪麗·斯圖亞特更適合，但她還是不想公開自己的意圖，這樣可能會危害自己的安全，畢竟「人們膜拜的是旭日東昇，而非夕陽西下」。她並不反對立瑪麗·斯圖亞特為王位接班人，只是亨利八世的繼承法可能會妨礙她這麼做，且無論瑪麗·斯圖亞特提出什麼樣的主張，都得經過國會討論。「畢竟我是嫁給了這個王國，當我宣誓時，便已無法改變國家法律。」伊麗莎白女王如此提醒威廉·梅特蘭。女王繼續表示，最好是讓蘇格蘭當個友善的鄰居，這樣就可以贏得英國民心；他們就更有可能將她視為合法的王位繼承人。
儘管如此，此事依然危機四伏。
「也許我會喜歡我的裹屍布，但自古以來，統治者怎麼可能關照將繼位的孩子呢？」伊麗莎白女王如此斷言，「我姐姐在位期間，我對這種事情的體會可多了，有多少人渴望讓我掌權？又有多少人忙著想要陷害我？身為一個統治者，身繫家國希望，永遠都寢食難安。若讓各國知道未來誰將接下我的王位，我就永遠不得安寧了。」
從瑪麗·斯圖亞特的觀點來看，這個答案無法滿足她；儘管如此，對於她的要求來說，伊麗莎白女王已經擺出最友善又合理的態度，這也為兩位女王開啟了更多真誠交心的機會。
九月十七日，伊麗莎白女王再度去信給蘇格蘭女王瑪麗·斯圖亞特，要求她核准《愛丁堡條約》，但威廉·梅特蘭在第二次謁見伊麗莎白女王時，態度顯得更為強硬，他對伊麗莎白女王提出警告，若瑪麗·斯圖亞特無法成為英國王位的繼承人，可能會採取強制行動。他提醒伊麗莎白女王：「儘管女王陛下認定自己的地位合法，但歐洲各國顯然不是這麼想。」梅特蘭大使如此赤裸裸的要求，彷彿想要從她身上強行得到她願意重新考慮並更改《愛丁堡條約》的保證，顯然這讓女王感到不安。塞西爾自然也對此感到不悅，畢竟《愛丁堡條約》是他的心血。而正因為蘇格蘭女王的天主教信仰與對英國王位的覬覦，塞西爾一點也不信任瑪麗·斯圖亞特，他也曾坦率地直接向伊麗莎白女王挑明這一點，伊麗莎白女王旋即對於自己透露太多口風感到後悔不已。
到了十二月份，她不斷要求，希望與瑪麗·斯圖亞特盡快一會，以討論彼此之間的分歧，她再度執筆寫信給瑪麗·斯圖亞特，親自提議兩人相見。瑪麗·斯圖亞特以熱情的態度響應，表達自己對於與「最親愛的姐妹」當面相見，感到歡欣期待，並且不斷向托馬斯·倫道夫詢問有關伊麗莎白女王的問題，包括「她的健康情形、活動狀況、飲食習慣與各式各樣的問題」。看著表姑的畫像，她表示「希望兩人其中一人是男性，這樣就可以通過聯姻一統兩國。」
「我想只要她們兩人更熟稔以後，女王便可以就宗教問題，跟她（瑪麗·斯圖亞特）進行更多討論。」梅特蘭大使充滿希望地告訴塞西爾。但他並沒有說出他最擔心的事，瑪麗·斯圖亞特的才智並不及伊麗莎白女王，這一點也是瑪麗·斯圖亞特的智囊們最大的顧慮。但要讓兩人見面，並非一夕之間便可成行，在接下來數月的書信往返與外交協商下，兩國的女王都越來越等不及，她們非常期待能夠見面。
梅特蘭大使寫信給塞西爾道：「我國女王醉心於歡欣的情緒中，一直期待著能夠與她表姑會面，完全不需要任何勸說，但她的意念實在太堅決，顧問們都不敢提出建議。」蘇格蘭與英格蘭的貴族們，對於提供資金讓瑪麗·斯圖亞特正式出訪英國，皆激烈反對，伊麗莎白女王的智囊們也用法國政界反瑪麗·吉斯的聲浪來警告她，顯然法方也反對瑪麗·斯圖亞特此行。但伊麗莎白女王並不聽從，對她來說，和瑪麗·斯圖亞特相見可以得到的好處很多，這份希望早已超越冒犯法國的風險。
伊麗莎白女王如此渴望會見小表親，背後其實也有令人得以信服的個人因素。伊麗莎白女王是個極度自負的人，她非常好奇地想要知道，瑪麗·斯圖亞特是否如傳聞中的那麼貌美，而且她非常希望答案是否定的。對於瑪麗·斯圖亞特那使歐洲男性傾倒追求的名聲在外，伊麗莎白女王很是嫉妒，她無法忍受瑪麗·斯圖亞特的爭寵。當一名德國籍大使告訴她，據傳瑪麗·斯圖亞特是個非常美麗的女人時，伊麗莎白女王立即回嘴表示不相信，因為「她絕對比蘇格蘭女王還要優越」。
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在英國方面，伊麗莎白女王順利度過了達德利醜聞的災難，繼續維持聲望。一五六一年九月八日，當她準備入住倫敦的聖詹姆士宮時，約有一萬人來到現場想要親眼看看女王，「這些人都非常高興，也非常喜歡她」。
那一年的秋天，瑞典埃裡克王再度提出要求，盼能與伊麗莎白女王共結連理。儘管那一段時間伊麗莎白女王積極鼓勵他，但根據誇德拉大使表示，女王這麼做的目的，只是為了避免埃裡克王將目標轉向蘇格蘭女王瑪麗·斯圖亞特。但要不了多久，就連這個勇敢無畏至今不渝的追求者，也對她失去了興趣，放棄了追求。七年後芬蘭約翰公爵罷免埃裡克王，並在一五七七年謀殺了他。
達德利的命運依然在走下坡。一五六一年十一月時，有人看到伊麗莎白女王喬裝打扮，從後門溜出懷特霍爾，去看他的射箭比賽。十二月二十六日，伊麗莎白女王讓他的兄弟安布洛斯·達德利恢復華威伯爵（Earldom of Warwick）的地位，這是過去達德利的父親與已故兄長的爵位。此外，女王還賜予華威城堡與英國中部的大片土地，而十二月二十二日時，達德利成為倫敦律師學院中的內殿律師學院成員，並在一場土地糾紛中提供證據。五天後，他在律師學院的大廳主持了一場壯觀的集會，這一切都只為了一件事，讓女王得以嫁給達德利。
達德利本人則時常希望醜聞能有雨過天晴的一天，但薩克森公爵派出的大使曾向主公轉告，伊麗莎白女王向他透露：「從未想過與達德利結婚，但她對他的喜愛，比起其他人更甚，因為在她姐姐在位期間，所有的人將她孤立時，達德利對她的友善與注意力卻從未減過一絲一毫，甚至還賣掉自己的財產，在經濟上援助她。她只是認為，針對他的信賴與持續的關懷，自己應該湧泉以報。」
但達德利要的不只這些。一五六二年一月，他再度尋求誇德拉大使的幫助，要求菲利普國王寫封推薦信支持他追求伊麗莎白女王。這次他並未再用假裝自己要改信天主教的手段來欺騙西班牙方面，只是暗示法國方面提出一份豐厚的賄賂，希望他運用自己在女王面前的影響力。但誇德拉大使才不想被騙第二次。他只是圓滑地表示，女王陛下知道菲利普國王非常希望看到她出嫁，同時女王也知道，菲利普國王對達德利有很高的期待。因此要請主公寫一封推薦信，絕對是無意義之舉。在誇德拉大使的眼中，兩人成婚最大的絆腳石其實是女王在婚姻議題上捉摸不定的心意；但若達德利希望的話，大使願意再與女王談談這個話題。
達德利的確這麼希望，於是不久之後，誇德拉主教便向女王詢問，在婚姻議題上她是否已經下定決心。
「我與初生之日一樣，在婚姻關係上孑然一身。」她告訴他，同時強調，自己已經決心不接受任何素未謀面的追求者，這也代表她非常清楚，自己可能只能嫁給英國人了，「也就是說，她認為找不到比羅伯特·達德利更適合自己的人了」。她繼續表示，自己最希望的就是接到友善的他國國王來信，像是菲利普國王，建議她嫁給達德利，這樣她的臣子們才不會指責，她是為了自己的私慾而選擇達德利。這一點，她表示，也是達德利所希望的。
毫不令人意外的是，誇德拉大使對她的動機感到十分懷疑，並且「以一種開玩笑的方式」迴避了她的問題，還建議她不要猶豫太久，應該趕緊滿足達德利的要求，而且他知道菲利普國王將因此感到欣喜。事實上，誇德拉大使與菲利普國王都知道，伊麗莎白女王一旦下嫁達德利，將會犧牲地位與名望，動搖她的王權，甚至讓天主教有機會在英國復辟——就像現在英國以北的蘇格蘭一樣。
就在此時，伊麗莎白女王將當年他父親的許多封地，全都歸還給達德利，讓他能夠維持自己的地位。當年稍晚，女王授予他一份利益豐厚的執照，讓他可以免稅出口毛料。此舉再度引起新一波的流言，認為女王將嫁給他。但到了六月時，倫敦出現傳聞，指稱女王與達德利在友人潘布魯克伯爵（Earl of Pembroke）於倫敦的住處貝納德城堡秘密結婚。女王覺得這樣的傳聞非常有趣，同時以取笑誇德拉大使為樂，告訴他寢宮侍女們都在詢問，現在他是否該像親吻女王一樣親吻達德利的手。而達德利本人則公開表示，伊麗莎白女王已經應允要嫁給他，「只是不在今年」。
英國國會指控誇德拉大使為散佈謠言的始作俑者，但他否認這樣的行為，僅表示自己因為無法告訴大家女王已婚的訊息，甚感抱歉。
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一五六二年春天，萊諾克斯伯爵夫人與兒子達恩裡勳爵，終於脫離在倫敦家中遭軟禁的慘況，再度成為女王跟前的紅人。但萊諾克斯伯爵夫人是個野心勃勃的女人，不久之後，她又開始積極做媒，想撮合達恩裡勳爵與瑪麗·斯圖亞特，借此融合兩股問鼎英國王位的勢力。然而這樣的可能性早已觸動伊麗莎白女王的敏感神經，只是這次萊諾克斯伯爵夫人實在太過火了，她的計劃暗示著要推翻女王。計劃很快便曝了光，而她那疑似叛國的計劃，讓她遭到逮捕成為倫敦塔中的囚犯。
到了五月，經過數月的協商觸礁，瑪麗·斯圖亞特再度派遣威廉·梅特蘭大使前往英國，要他帶上口信，希望促成英方盡快邀請她進行外交訪問。伊麗莎白女王告訴梅特蘭大使，她絕對不會讓任何事情延宕與瑪麗·斯圖亞特的會面，心情大好的瑪麗·斯圖亞特於是去信給吉斯公爵：「我猜你想像得到，當世界看到我們倆——英國女王與我——相處得如此融洽，會有多麼震驚！」
不幸的是，法國爆發了一場天主教與胡格諾教派之間的衝突，尼可拉斯·瑟洛摩頓爵士與羅伯特·達德利便呼籲伊麗莎白女王全力支持遭受到脅迫的胡格諾教派人士，之後這些人也許就能協助她奪回加萊港以實現她內心最渴望的一個夢想。瑟洛摩頓爵士提醒她，與天主教忠僕瑪麗·斯圖亞特見面，或是與吉斯公爵的任何關聯，在此時都不合時宜。